Tủ an toàn sinh học cấp III cung cấp sự đảm bảo an toàn tuyệt đối mà các tủ an toàn loại I và loại II không thể cung cấp. Tất cả các tủ an toàn sinh học loại 3 đều được đóng kín hoàn toàn. Thí nghiệm được thực hiện hoàn toàn qua găng tay cửa sổ phía trước. Trong hoạt động hàng ngày, bên trong tủ sẽ luôn duy trì áp lực âm. Ngay cả trong trường hợp của một sự thất bại về hệ thống phòng chống ô nhiễm vật lý, nó có thể.
Tất cả các tủ an toàn sinh học loại 3 được bảo vệ bởi không khí sạch được lọc bởi bộ lọc HEPA và ngăn ngừa sự lây nhiễm chéo mẫu. Khí thải thường được lọc qua HEPA. Hoặc sử dụng hai bộ lọc HEPA cạnh nhau. Các mục cần thiết cho thí nghiệm được đưa vào tủ cùng với kênh cách ly đặt ở bên cạnh tủ. Tủ an toàn cấp 3 thường dẫn khí thải vào phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, không khí cũng có thể được thải trực tiếp ra môi trường bên ngoài thông qua ống xả bên ngoài. Khi sử dụng hệ thống đường ống xả, tủ an toàn ba cấp cũng thích hợp cho các hoạt động vi sinh đòi hỏi phải bổ sung các hóa chất độc hại trong quá trình thử nghiệm. Tất cả các tủ an toàn sinh học loại 3 có thể được sử dụng trong các thí nghiệm vi sinh học liên quan đến mức độ an toàn sinh học ở mức một, hai, ba và bốn.