Tủ an toàn sinh học cấp độ thứ hai cũng giống như tủ an toàn sinh học. Khí cũng chảy từ ngoài vào tủ an toàn sinh học thứ cấp, thường được gọi là dòng chảy. Dòng chảy ngăn chặn các sol khí tạo ra trong các hoạt động vi sinh vật từ thoát ra từ cửa sổ hoạt động phía trước của tủ đến phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, chúng khác với tủ an toàn sinh học chính trong đó chỉ có không khí được lọc (tiệt trùng) HEPA được phép chảy qua bề mặt làm việc. Quạt được tích hợp hút không khí thông qua việc mở cửa phía trước vào tủ và vào lưới tản nhiệt phía trước. Do đó, không khí đã không được lọc bởi bộ lọc sẽ không trực tiếp vào khu vực làm việc, do đó bảo vệ các mẫu và dụng cụ được lưu trữ bên trong tủ an toàn khỏi bị ô nhiễm bởi không khí bên ngoài.
Một tính năng độc đáo của tủ an toàn sinh học thứ cấp là bộ lọc được lọc bởi các bộ lọc HEPA theo chiều dọc (không theo hướng) và dòng khí đi xuống được hình thành bên trong tủ. Dòng không khí liên tục có thể tạo ra các nhiễm trùng không khí bên trong bên trong tủ, do đó bảo vệ các mẫu được lưu trữ trong tủ khỏi nhiễm trùng. Loại luồng không khí này được gọi là lún.
Sự khác biệt chính giữa các loại tủ an toàn sinh học thứ cấp khác nhau là tỷ lệ khí thải và tỷ lệ khí được tuần hoàn qua không khí ở áp suất cao là khác nhau. Ngoài ra, các tủ an toàn sinh học thứ cấp khác nhau có các phương pháp xả khác nhau: Một số tủ an toàn lọc không khí trực tiếp vào phòng, và một số được xả qua vỏ nối với ống thông gió chuyên dụng hoặc thông qua hệ thống ống xả của tòa nhà. Bên ngoài toà nhà.
Ngoài những khác biệt nêu trên, tất cả các tủ an toàn sinh học thứ cấp, như tủ an toàn sinh học cấp 1, có thể bảo vệ các nhà khai thác và môi trường phòng thí nghiệm khỏi bị tổn hại. Ngoài ra, tủ an toàn thứ cấp cũng bảo vệ các mẫu sản phẩm khỏi bị nhiễm bẩn trong quá trình hoạt động của vi sinh vật. Tủ an toàn sinh học thứ cấp có thể được sử dụng trong hoạt động yếu tố sinh học ở một, hai hoặc ba mức độ an toàn sinh học.